斯卡比亚原本就对托斯卡十分爱慕，但却始终不得美人芳心，此时他见机不可失，于是利用一把在教堂中找到的女用折扇，挑拨起托斯卡的猜疑和嫉妒心，想藉此透过托斯卡找到卡伐拉多西。托斯卡被斯卡比亚一番话激怒之后，决心不放过背叛爱情的男友；斯卡比亚见托斯卡中了嫉妒毒药，想上前安慰，却被托斯卡拒绝。斯卡比亚随后安排人员跟监伤心欲绝的托斯卡的行踪，另一方面他对自己的一石二鸟之计逐渐产生效用，暗自窃喜，在教堂的感恩弥撒歌声中，他不禁得意高呼：“托斯卡，你让我忘记了上帝的存在！”
第二幕 法内斯宫：警察总督斯卡比亚房内
斯卡比亚正在享用晚餐，但是他心里面却惦记着越狱政治犯安杰洛提以及共犯卡伐拉多西的下落；同时斯卡比亚还差人递了一封短柬给托斯卡，请托斯卡在表演完后抽空来总督府，有要事相告。这时在皇宫外广场上正为了拿破仑法军被击退而举行盛大的庆祝活动，托斯卡也应邀在活动中演唱。
史卡比亚助理史波雷塔随后进来禀报搜捕结果：虽然暂时未发现安杰洛提的踪迹，但却逮到了协助逃亡的共犯卡伐拉多西。史卡比亚向卡伐拉多西追问安杰洛提的下落，但卡伐拉多西都以不知情拒答；正巧，托斯卡也匆忙到来，史卡比亚则趁机藉题发挥：他下令收押卡伐拉多西，准备看看托斯卡会有何反应，而卡伐拉多西临去前还一再交待托斯卡保持沉默，否则他将命丧黄泉。此时房内只留下史卡比亚和托斯卡二人，史卡比亚假意请托斯卡坐下休息，但却开门见山地询问有关安杰洛提藏匿一事；托斯卡闪躲其词，而地牢内又传来卡伐拉多西坚决否认与安杰洛提有关之事，耐不住性子的史卡比亚干脆告诉托斯卡：她的沉默只会为卡伐拉多西带来更多的痛苦。最后托斯卡还是忍受不了卡伐拉多西被酷刑折磨的惨叫声、还有史卡比亚的施压逼迫，她终于吐露安杰洛提的藏匿地点。
史卡比亚应托斯卡请求，暂时释放卡伐拉多西。托斯卡眼见爱人片体鳞伤，心痛难忍，而卡伐拉多西则十分在意托斯卡是否保守秘密，此时史卡比亚故意说出安杰洛提的下落，惹得卡伐拉多西大骂托斯卡是叛徒。突然间，一名史卡比亚的助理冲进来报告拿破仑大军胜利、意大利溃败的消息，卡伐拉多西闻言高声欢呼，并且诅咒史卡比亚的暴政终有灭亡之日。史卡比亚顾不得托斯卡的乞求，再次下令收押卡伐拉多西，托斯卡则提出条件，看看史卡比亚到底要什么才能交换卡伐拉多西的生命。老谋深算的史卡比亚则说，他虽然贪财，但也不能违背原则，如果要他改变决定的话，这时就必须要有“特别的报酬”，而今晚，托斯卡就是他唯一的报酬！
托斯卡原本想逃出史卡比亚的玷辱，此时窗外传来一阵小鼓声，这是行刑队出发前往刑场的信号，史卡比亚告知托斯卡：卡伐拉多西只剩下一小时的生命，要不要救人，全看托斯卡的决定。托斯卡忍不住暗自悲叹，她为了艺术、为了爱情，从不伤害他人，甚至还经常暗中帮助贫苦无依之人；她每天也前往教堂祈祷，向圣母献上珠宝，在夜晚星空下高歌颂赞上天，但为什么此时老天爷却给了她这样的回报？(咏叹调：为了艺术，为了爱)
在史卡比亚的逼迫下，托斯卡虽然悲愤难忍，但为了救出卡伐拉多西，她还是答应了史卡比亚的求欢，而史卡比亚告诉托斯卡，为了圆谎，他必须让众人相信：政治犯卡伐拉多西“已经”被处死了。他的方法是以空包弹假装作戏，让卡伐拉多西“死而复活”(事实上史卡比亚只是虚应托斯卡，他暗地里已经下令要以真枪实弹解决掉卡伐拉多西)。托斯卡答应史卡比亚的要求后，她同时也要史卡比亚签发两张通行证，好让她和卡伐拉多西在事后安然逃离。当史卡比亚签发通行证时，托斯卡瞥见餐桌上有一把短刀，她拿起刀子，视适当时机准备刺杀史卡比亚。当史卡比亚色眯眯地走来、正要拥抱托斯卡时，冷不防地被托斯卡一刀刺进心脏，托斯卡将一切怨气与怒气此时一并爆发出来。她对着躺在血泊中挣扎的史卡比亚大喊：“这就是托斯卡之吻！”她一步步逼进史卡比亚，说她受够了虐待，而今天这个就是史卡比亚的下场。
当托斯卡从血腥疯狂中清醒后，她盯着史卡比亚的尸体，若有所思地说：“这个男人终于死了，过去整个罗马曾在他脚下颤栗不安！”托斯卡清理完身上血迹，从史卡比亚紧握的手中拿走了两张通行证，临走前还放了两只蜡烛在史卡比亚头部两侧，并且从墙上取下十字架，放在史卡比亚胸前。在一阵急促鼓声中，托斯卡匆忙离开总督府。
第三幕 天使城堡天台
远方传来的牧童歌声划过天际，时间已是深夜将尽、黎明来临之前。卡伐拉多西在警卫队带领之下登场，交由一名狱卒签收。警卫队离去后，卡伐拉多西请求狱卒让他写一封信留给心爱的托斯卡，他看着天上繁星，心中一阵激动与感叹，不禁回忆起过去与托斯卡相处的美好时光，即使即将面对死亡，他依然热爱曾经活过的生命！(咏叹调：今夜星光灿烂)
当卡伐拉多西陷入沉思中，托斯卡随即便衣登场。她告诉卡伐拉多西如何与史卡比亚达成交易，而在最后一刻又如何手刃史卡比亚，取得通行证。卡伐拉多西闻言大受感动，于是跪地亲吻托斯卡那双为了救他而饱受折磨的小手。托斯卡趁机告诉卡伐拉多西，待会行刑队执行枪决时，要他随枪响应声倒地，而且是愈逼真愈好；等到众人散去时，他们就可以一起远走高飞、享受自由。
就在小两口沉浸在即将到来的幸福与喜悦中，行刑队也陆续来到天台上，准备对卡伐拉多西执行史卡比亚所“安排”的枪决；在枪响那一刹那，托斯卡还在一旁偷偷激赏卡伐拉多西的逼真表演，但是等到行刑队退场之后、她前去掀开遮盖卡伐拉多西的斗篷时，才发现爱人已经气绝多时。此时史卡比亚的助理史波雷塔发现史卡比亚遭人刺杀，率人前来捉拿托斯卡，托斯卡在无路可去之下，登上城墙，对天高喊：“史卡比亚，上帝面前见吧！”随即纵身跃下，只留下不知所措的警卫队士兵。
